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藥敏試驗的步驟
發布時間:2016-12-22

由于藥敏試驗要求比較嚴格,條件比較高,僅僅在大中專院?;蚩蒲械ノ揮刑跫目梢圓僮?,一些養殖場或一些門診難有條件進行藥敏試驗的操作。針對這個問題,筆者經過幾年的總結和實踐,逐漸總結出幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法,現簡單介紹如下。

一、試驗步驟

1.試驗材料:

1.1普通營養瓊脂培養基:可去生化試劑店購買,做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基,如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。

1.2藥敏試紙:購買或自制。

1.3細菌:待做藥敏試驗的細菌。

1.4接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯。

1.5移液器、滴頭。

2.試驗準備:

2.1藥敏片的準備:購買或自制。

2.1.1藥敏片的制備:取新華1號定性濾紙,用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中,瓶口以單層牛皮紙包扎。經15磅高壓、15-20分鐘消毒后,放在37℃溫箱或烘箱中數天,使完全干燥。

2.2.2抗菌藥紙片制作:在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液0.25毫升,并翻動紙片,使各紙片充分浸透藥液,翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱,放37℃溫箱內過夜,干燥后即密蓋,如有條件可真空干燥。切勿受潮,置陰暗干燥處存放,有效期3-6個月。

2.2藥液的制備(用于商品藥的試驗):按商品藥使用治療量的比例配制藥液;如商品藥“百病消”按其說明量治療量0.01%飲水,可按這個比例配制藥液,可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。

3.試驗操作方法:

3.1藥敏片法

3.1.1在“超凈臺”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式;用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌,以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布于平皿。(另可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面,涂布均勻致密)。

3.1.2將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停,取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼,可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果,要求藥敏片能有規律的分布于平皿培養基上;一般可在平皿中央貼一片,外周可等距離貼若干片(外周一般可貼七片),每種藥敏片的名稱要記住。

3.1.3將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后,觀察效果。

3.2牛津杯法

3.2.1在“超凈臺”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式:用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌,以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布于平皿。(另可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。要求涂布均勻致密。)

3.2.2以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管(內徑6mm、外徑8mm、高10mm圓形小管,管兩端光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培養基上,輕輕加壓,使其與培養基接觸無空隙,在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。幾分鐘后,向各小管中滴加一定數量的各種藥液,勿使其外溢。在37℃下培養8-18小時,觀察結果。

3.2.3將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后,觀察效果。

3.3打孔法:該法較簡單,成本低,易操作,比較適用于商品藥物的檢測。

3.3.1在“超凈臺”中,用經(酒精燈)火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物,以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式:用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌,以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。找到第二點劃線至平皿的1/2,依次劃線,直至細菌均勻密布于平皿。(另可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面,涂布均勻致密。)

3.3.2以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管(外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米,管的兩端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培養基上打孔,將孔中的培養基用針頭挑出,并以火焰封底,使培養基能充分的與平皿融合(以防藥液滲漏,影響結果)。

3.3.3加樣:按不同藥液加樣,樣品加至滿而不溢為止。

3.3.4將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后,觀察效果。

二、結果觀察:

過夜培養后形成一個抑菌圈,抑菌圈越大,說明該菌對此藥敏感性越大,反之越小,若無抑菌圈,則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。

三、判定標準:

1.藥敏試驗的結果,應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

2.藥物敏感試驗判定標準參考在9毫米以上為敏感,6-9毫米為低敏,無抑菌圈為不敏。

四、影響藥敏結果的因素

1.培養基:應根據試驗菌的營養需要進行配制。傾注平板時,厚度約5-6mm,一般90mm直徑的培養皿,傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質。

2.細菌接種量:細菌接種量應恒定,如太多,抑菌圈變小,能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

3.藥物濃度:藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果,需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。

4.培養時間:一般培養溫度和時間為37℃、8-18小時,有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素,可將已放好抗菌藥的平板培養基,先置4℃冰箱內2-4小時,使抗菌藥預擴散,然后再放37℃溫箱中培養,可以推遲細菌的生長,而得到較大的抑菌圈。

五、應用

藥物敏感試驗后,應選擇高敏藥物進行治療,也可選用兩種藥物協助使用,以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑,因為我們藥敏試驗是藥液直接和細菌接觸,而在給禽用藥的時候,必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果,所以在給禽用藥時,高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法,這樣才會達到好的治療效果。

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